تست چسبندگی سلولی؛ اصل تست های رنگ سنجی اندازه گیری یک نشانگر بیوشیمیایی برای ارزیابی فعالیت متابولیک سلول ها است. معرف های مورد استفاده در آزمایش های رنگ سنجی، رنگی را در پاسخ به زنده ماندن سلول ها ایجاد می کنند و امکان اندازه گیری رنگ سنجی زنده بودن سلول را توسط اسپکتروفتومتر فراهم می کنند. این آزمایشات قابل اجرا، آسان برای انجام و نسبتاً مقرون به صرفه برای خطوط سلولی چسبنده یا معلق هستند. کیت های آنالیز رنگ سنجی تجاری از چندین شرکت در دسترس هستند و اغلب روش های آزمایشی برای این آزمایش ها در بسته های کیت موجود است.
برای کسب اطلاعات بیشتر و دریافت خدمات با ما تماس بگیرید.
تست MTT
تست MTT (3-(4،5-دی متیل تیازول-2-ایل)-2-5-دی فنیل تترازولیوم بروماید) یکی از رایج ترین تست های رنگ سنجی برای ارزیابی سمیت سلولی یا زنده ماندن سلولی است. این سنجش در درجه اول فعالیت آنزیم های میتوکندری مانند سوکسینات دهیدروژناز را اندازه گیری می کند. همچنین با تعیین عملکرد میتوکندریایی سلول ها، زنده بودن سلول را تعیین می کند. در این روش، MTT توسط NADH به فرمازان بنفش کاهش می یابد. این محصول را می توان با جذب نور در طول موج مشخصی اندازه گیری کرد.
مزایا
تست های رنگ سنجی در سنجش سمیت سلولی و زنده ماندن سلولی این روش بسیار برتر از روش های حذف رنگ است که قبلا ذکر شد. از آنجا که استفاده از آن آسان، ایمن است، قابلیت تکرارپذیری بالایی دارد و به طور گسترده ای برای تعیین زنده ماندن سلولی و تست سمیت سلولی استفاده می شود.
معایب
فرمازان MTT در آب نامحلول است و یک سوزن بنفش رنگ در سلول ها ایجاد می کند.
کریستال ها را تشکیل می دهد. بنابراین، قبل از اندازه گیری جذب، یک حلال آلی مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) یا ایزوپروپانول برای حل کردن کریستال ها مورد نیاز است. علاوه بر این، سمیت سلولی MTT فرمازان، حذف محیط کشت سلولی از چاهک های پلیت را به دلیل شناور بودن سلول ها با سوزن های MTT فورازان، دشوار می کند و خطای چاه به چاه به دم قابل توجهی را ایجاد می کند.
آزمایش‌های کنترلی اضافی باید برای کاهش نتایج مثبت یا منفی کاذب ناشی از تداخل پس‌زمینه ناشی از ادغام ذرات انجام شود. این تداخل می تواند منجر به تخمین بیش از حد بقای سلول شود. معمولاً می توان وجود ذرات را بررسی کرد، اما بدون معرف های سنجش، با کم کردن میزان جذب پس زمینه سلول ها.
مقالات بیشتر:
تست MTS
تست MTS (5-(3-کربوکسی متوکسی فنیل)-2-(4،5-دی متیل تیازول)-3-(4-سولفوفنیل) تترازولیوم، تست نمک داخلی) یک تست رنگ سنجی است. این سنجش مبتنی بر تبدیل نمک تترازولیوم به فرمازان رنگی توسط فعالیت میتوکندریایی سلول های زنده است. مقدار فورمازان تولید شده به تعداد سلول های زنده در کشت بستگی دارد و با اسپکتروفتومتر در طول موج 492 نانومتر قابل اندازه گیری است.
مزایا
مطالعات قبلی نشان می دهد که تست سمیت سلولی MTS در شرایط آزمایشگاهی تمام ویژگی های یک سیستم اندازه گیری خوب را از نظر سهولت استفاده، دقت و نشان دادن سریع سمیت ترکیب می کند. تست MTS یک تست سمیت سلولی سریع، حساس، اقتصادی و اختصاصی در شرایط آزمایشگاهی است. عملکرد این آزمایش در مقایسه با سایر آزمایشات سم شناسی بسیار رقابتی است. این سنجش ویژگی های ایده آلی را برای اندازه گیری سمیت سلولی فراهم می کند زیرا استفاده از آن آسان، سریع، قابل اعتماد و ارزان است. بنابراین، می توان از آن برای ارزیابی های سم شناسی در محل استفاده کرد.
معایب
سطح جذب اندازه گیری شده در 492 نانومتر تحت تأثیر زمان انکوباسیون، نوع سلول و تعداد سلول است. نسبت معرف های تشخیص MTS به سلول های کشت نیز بر سطح جذب اندازه گیری شده تأثیر می گذارد. مطالعات قبلی یک رابطه خطی بین زمان انکوباسیون و جذب برای زمان‌های انکوباسیون کوتاه‌تر از 5 ساعت را پیشنهاد کرده‌اند. بنابراین زمان انکوباسیون مناسب برای این آزمایش 1 تا 3 ساعت است.
تست XTT
تست های رنگ سنجی در سنجش سمیت سلولی و زنده ماندن سلولی MTT یک ترکیب فرمازان نامحلول در آب تولید می کند که برای اندازه گیری جذب رنگ باید حل شود، در حالی که XTT یک رنگ محلول در آب تولید می کند. روش XTT صرفاً برای اندازه گیری تکثیر است، بنابراین یک راه حل عالی برای تعیین کمیت سلول ها و تعیین زنده ماندن آنها است. XTT برای آزمایش تکثیر سلولی در پاسخ به عوامل رشد مختلف استفاده می شود. همچنین برای ارزیابی سمیت سلولی استفاده می شود.
این سنجش بر اساس کاهش نمک تترازولیوم XTT به ترکیبات فورازان نارنجی رنگ توسط سلولهای فعال متابولیکی است. فورمازان نارنجی رنگ در آب محلول است و چگالی آن را می توان با اسپکتروفتومتر اندازه گیری کرد. بین تراکم فورمازان و تعداد سلولهای زنده رابطه خطی وجود دارد. استفاده از صفحات چند چاهی و اسپکتروفتومتر یا الایزا ریدر امکان کار با تعداد زیادی نمونه را فراهم می کند و نتایج را به راحتی و سریع به دست می آورد. روش این آزمایش شامل کشت سلولی در یک صفحه 96 چاهی، افزودن معرف XTT و انکوباسیون به مدت 2-24 ساعت است. رنگ نارنجی در طول دوره جوجه کشی ایجاد می شود و شدت رنگ را می توان با اسپکتروفتومتر اندازه گیری کرد.
مزایا
تست XTT یک روش سریع، پاسخگو، آسان برای استفاده و ایمن است. همچنین از حساسیت و هم دقت بالایی برخوردار است.
معایب
عملکرد سنجش XTT به ظرفیت کاهش سلول های زنده با فعالیت دهیدروژناز میتوکندری بستگی دارد. بنابراین عواملی وجود دارند که می توانند بر میزان جذب نهایی تأثیر بگذارند که به شرح زیر است:
- تنظیم آنزیمی،
- PH،
- غلظت یون سلولی (به عنوان مثال سدیم، کلسیم، پتاسیم)،
- تنوع چرخه سلولی
- تغییرات در ظرفیت کاهنده سلول های زنده ناشی از سایر عوامل محیطی.
تست WST-1
تست تکثیر سلولی WST-1 (2- (4-یدوفنیل) -3- (4-نیتروفنیل) -5- (2،4-دی سولفوفنیل) -2H تترازولیوم مونوسدیم نمک) یک آزمایش رنگ سنجی ساده است که برای اندازه گیری ارزش نسبی نمک محلول در آب در محیط کشت سلولی آزاد می شود. در طول دوره انکوباسیون، واکنش تغییر رنگی ایجاد می کند که به طور مستقیم با مقدار دهیدروژناز میتوکندری در کشت سلولی متناسب است. بنابراین، سنجش فعالیت متابولیکی سلول ها را اندازه گیری می کند. برای انجام آزمایش، معرف آماده WST-1 مستقیماً به محیط سلول های کشت داده شده در صفحات چند چاهی اضافه می شود. سپس به کشت ها 30 دقیقه تا 4 ساعت داده می شود تا معرف به شکل رنگ کاهش یابد. سپس صفحه بلافاصله در 450 نانومتر با قرائت مرجع در 630 نانومتر خوانده می شود.
مزایا
استفاده از آن آسان، ایمن، بسیار قابل تکرار و به طور گسترده برای تعیین زنده ماندن سلولی و تست سمیت سلولی استفاده می شود. علاوه بر این، نشانگرهای قرمز فنل در محیط کشت سلولی با واکنش رنگ تداخلی ندارند. از آنجایی که رنگ رنگی تولید شده در پایان آزمایش محلول در آب است، نیازی به حلال و زمان انکوباسیون اضافی ندارد.
معایب
زمان استاندارد انکوباسیون دوره WST-1 2 ساعت است. هنوز مشخص نیست که آیا افزودن یکباره WST-1 تأثیر عوامل آزمایش را بر روند زنده ماندن نسبی سلول در مقاطع زمانی مختلف منعکس خواهد کرد یا خیر.
مقالات بیشتر:
تست WST-8
تست WST-8 یک تست رنگ سنجی برای تعیین تعداد سلول های زنده است و می تواند برای تست های سمیت سلولی و همچنین تست های تکثیر سلولی استفاده شود.
WST-8، بسیار پایدار و محلول در آب، در کیت شمارش سلولی-8 (CCK-8) استفاده می شود. به خصوص در pH خنثی نسبت به WST-1 حساس تر است. با توجه به واسطه الکترونی، 1 متوکسی PMS در این کیت بسیار پایدار است، CCK-8 حداقل به مدت 6 ماه در دمای اتاق و 1 سال در دمای 0-5 درجه سانتی گراد پایدار است. از آنجایی که WST-8، WST-8 فورمازان و 1-متوکسی PMS هیچ گونه سمیت سلولی روی سلول ها در محیط کشت ندارند.
مزایا
WST-8 نفوذپذیر به سلول نیست و در نتیجه سمیت سلولی پایینی دارد. بنابراین، پس از سنجش، امکان ادامه آزمایشات بیشتر با استفاده از همان سلول ها وجود دارد. علاوه بر این، با احیای سلولی، فورمازان محلول در آب تولید می‌کند، که با اجازه دادن به روش سنجش ساده‌تر، به روش مزیت بیشتری می‌دهد و نیازی به مرحله اضافی برای حل کردن فورمازان ندارد.
معایب
یک نکته مهم این است که کاهش سوبستراهای سنجش تحت تأثیر تغییرات در فعالیت متابولیک داخل سلولی است که تأثیر مستقیمی بر زنده ماندن کلی سلول ندارد.
تست LDH (لاکتات دهیدروژناز)
تست های رنگ سنجی در سنجش سمیت سلولی و زنده ماندن سلولی تست سمیت سلولی LDH (لاکتات دهیدروژناز) یک روش رنگ سنجی برای آزمایش سمیت سلولی سلولی است. این روش نه تنها برای آزمایش سمیت سلولی با واسطه سلولی استفاده می شود. همچنین می تواند با انواع مختلف سلول برای ارزیابی سمیت سلولی با واسطه مواد شیمیایی سمی و سایر ترکیبات آزمایشی استفاده شود. این آزمایش به طور کمی آنزیم پایدار، سیتوزولی، لاکتات دهیدروژناز (LDH) را که از سلول های آسیب دیده آزاد می شود، اندازه گیری می کند.
LDH آنزیمی است که به طور معمول در سیتوپلاسم سلولی یافت می شود. هنگامی که زنده ماندن سلول کاهش می یابد، نشت غشای پلاسمایی افزایش می یابد و بنابراین آنزیم LDH در محیط کشت سلولی آزاد می شود. LDH آزاد شده توسط یک واکنش آنزیمی مرتبط اندازه گیری می شود که منجر به تبدیل نمک تترازولیوم به فرمازان قرمز رنگ توسط دیافوراز می شود. در مرحله اول + . در مرحله دوم، کاتالیزور (دیافوراز) H/H+ را از NADH/H+ به نمک تترازولیوم 2-(4-یدوفنیل)-3-(4-نیتروفنیل)-5-فنیل تترازولیوم کلرید (INT) منتقل می کند.
فعالیت LDH به عنوان اکسیداسیون NADH یا کاهش INT در یک دوره زمانی تعیین می شود. فرمازان قرمز حاصل حداکثر در 492 نانومتر جذب می شود و می توان آن را به صورت کمی در 490 نانومتر اندازه گیری کرد. شوینده Triton X-100 معمولاً به عنوان یک کنترل مثبت در سنجش LDH برای تعیین حداکثر آزادسازی LDH از سلول ها استفاده می شود. علاوه بر این، ذرات غشایی شناخته شده مانند سیلیس کریستالی را می توان به عنوان کنترل مثبت در تست LDH استفاده کرد.
مزایا
قابلیت اطمینان، سرعت و ارزیابی ساده از ویژگی های این آزمون است. از دست دادن LDH داخل سلولی و انتشار آن در محیط کشت، نشانگر مرگ غیرقابل برگشت سلولی به دلیل آسیب غشای سلولی است.
معایب
محدودیت اصلی این سنجش این است که سرم و برخی ترکیبات دیگر دارای فعالیت طبیعی LDH هستند. به عنوان مثال، سرم جنین گوساله دارای خوانش پس زمینه بسیار بالایی است. بنابراین، این روش به شرایط بدون سرم یا با سرم کم محدود می شود و زمان کشت سنجش را محدود می کند و پوشش سنجش را کاهش می دهد. زیرا دیگر نمی تواند اجازه دهد مرگ سلولی که باعث می شود مشخص شود.
تست SRB (سولفورودامین B)
سنجش SRB (سولفورودامین B) یک روش رنگ سنجی سریع و حساس برای اندازه گیری سمیت سلولی ناشی از دارو در هر دو کشت سلولی متصل و سوسپانسیون است. این آزمایش برای اولین بار توسط Skehan و همکارانش توصیف شد، این آزمایش برای استفاده در برنامه کشف داروی ضد سرطان در مقیاس بزرگ موسسه ملی سرطان (NCI) توسعه داده شد که در سال 1985 راه اندازی شد. SRB یک رنگ آمینوگزانتن صورتی روشن است که حاوی دو سولفونیک است. در شرایط کمی اسیدی، SRB به باقی مانده‌های اسید آمینه پایه پروتئین در سلولهای ثابت شده با TCA (اسید تری کلرواستیک) متصل می‌شود تا یک شاخص پروتئین سلولی حساس را فراهم کند. آزمون SRB همچنین برای ارزیابی تشکیل کلنی و انقراض کلنی استفاده می شود.
مزایا
تست SRB ساده، سریع و حساس است. این خطی بودن خوبی با تعداد سلول ارائه می دهد، امکان استفاده از غلظت رنگ اشباع را فراهم می کند، و حساسیت کمتری به نوسانات محیطی دارد. همچنین مستقل از متابولیسم میانی است و نقطه پایانی ثابتی را ارائه می‌کند که نیازی به اندازه‌گیری حساس به زمان سرعت واکنش اولیه ندارد و این سنجش را بسیار قابل تکرار می‌کند.
معایب
به دست آوردن و حفظ یک سوسپانسیون سلولی همگن مهم است. برای عملکرد آزمایشی بالا باید از توده/انبوه های سلولی اجتناب شود.
تست NRU (مصرف قرمز خنثی)
تست جذب قرمز خنثی (NRU) نیز یکی از پرکاربردترین تست های سمیت سلولی و زنده ماندن سلولی رنگ سنجی است. این سنجش توسط Borenfreund و Puerner توسعه یافته است. این سنجش بر اساس توانایی سلول های زنده برای جذب رنگ قرمز خنثی فوق حیاتی است. این رنگ کاتیونی ضعیف با انتشار غیر یونی غیر یونی به غشای سلولی نفوذ می کند و در لیزوزوم ها متمرکز می شود. سپس رنگ با استفاده از محلول اتانول اسیدی شده از سلول های زنده استخراج می شود و جذب رنگ با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه گیری می شود.
جذب قرمز خنثی به ظرفیت سلول ها برای حفظ گرادیان pH در طول تولید ATP بستگی دارد. در pH فیزیولوژیکی، بار خالص رنگ صفر است و به رنگ اجازه می دهد تا به غشای سلولی نفوذ کند. در داخل لیزوزوم ها یک گرادیان پروتون وجود دارد تا pH را کمتر از سیتوپلاسم نگه دارد. بنابراین، رنگ بارگیری می شود و در لیزوزوم ها حفظ می شود. هنگامی که سلول می میرد یا شیب pH کاهش می یابد، رنگ نمی تواند حفظ شود. علاوه بر این، جذب قرمز خنثی توسط سلول های زنده را می توان با تغییرات در سطح سلول یا غشاهای لیزوزومی اصلاح کرد. بنابراین، می توان سلول های زنده، آسیب دیده یا مرده را تشخیص داد. جذب لیزوزومی رنگ قرمز خنثی یک شاخص بسیار حساس برای زنده ماندن سلول است. این آزمایش می تواند زنده ماندن سلول را اندازه گیری کند و تکثیر سلولی، اثرات سیتواستاتیک یا اثرات سیتوتوکسیک را بسته به تراکم بذر اندازه گیری کند. جذب در طول موج 540 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر صفحه خوان چند چاهی اندازه گیری می شود.
مزایا
تست NRR نشانگر خوبی برای آسیب لیزوزومی است و سرعت و ارزیابی ساده از مزایای این تست است.
معایب
گزارش شده است که آزمایش NRR یا به طور حداقلی تحت تأثیر عوامل طبیعی مانند دما و شوری قرار می گیرد یا نه، اما عمدتاً تحت تأثیر آلاینده ها است.
تست CVS (تست بنفش کریستال)
سلول های چسبنده در طول مرگ سلولی از صفحات کشت سلولی جدا می شوند. این ویژگی می‌تواند برای ارزیابی غیرمستقیم مرگ سلولی و شناسایی تفاوت‌ها در نرخ تکثیر بر اثر تحریک با عوامل سیتوتوکسیک استفاده شود. یک روش ساده برای تشخیص چسبندگی حفظ شده سلول ها آزمایش کریستال ویولت است. در این آزمایش رنگ بنفش کریستالی به پروتئین ها و DNA سلول های زنده متصل می شود تا سلول های متصل با این رنگ رنگ آمیزی شوند. سلول‌ها در طول مرگ سلولی اتصال خود را از دست می‌دهند و متعاقباً از جمعیت سلولی ناپدید می‌شوند و میزان رنگ‌آمیزی کریستال بنفش را در کشت کاهش می‌دهند. تست کریستال ویولت یک روش غربالگری سریع و قابل اعتماد است که برای بررسی اثر داروهای شیمی درمانی یا سایر ترکیبات بر بقای سلولی و مهار رشد مناسب است.
مزایا
رنگ آمیزی بنفش کریستالی یک آزمایش سریع و همه کاره برای غربالگری زنده ماندن سلول ها در شرایط مختلف تحریک است. با این حال، به طور بالقوه توسط پاسخ های تکثیر که همزمان با پاسخ های مرگ سلولی رخ می دهد، به خطر می افتد. بنابراین، مهارکننده های شیمیایی کاسپازها یا نکروپتوز را می توان در آزمایش گنجاند. روش دیگر، مطالعات مولکولی می تواند برای پرداختن به ماهیت مرگ سلولی به طور خاص انجام شود، به عنوان مثال بیان بیش از حد یا تخریب.
معایب
تست کریستال ویولت به تغییرات در فعالیت متابولیک سلول حساس نیست. بنابراین، این سنجش برای مطالعات با استفاده از ترکیبات متاثر از متابولیسم سلولی مناسب نیست. در حالی که تست کریستال ویولت برای بررسی اثر داروهای شیمی درمانی یا سایر ترکیبات بر بقای سلولی و مهار رشد مناسب است، نمی تواند میزان تکثیر سلولی را اندازه گیری کند.