تست سمیت سلولی

یکی از روش‌های تست سمیت سلولی برای سنجش میزان مرگ سلولی روش MTT است که مبنای آن تشکیل رنگ فورمازان با احیا ماده MTT (دی متیل تیازول ۲ و ۵ دی فنیل تترازولیوم برمید) و یا سایر نمک‌های تترازولیوم است.

با گسستگی حلقه تترازولیوم MTT توسط آنزیم‌های میتوکندریایی در سلول‌های زنده، کریستال‌های فورمازان بنفش رنگ نامحلول تشکیل می‌شود. تشکیل این کریستال‌ها نشان دهنده فعال بودن آنزیم‌های زنجیره تنفسی و معیاری برای زنده بودن سلول‌ها است. با اندازه گیری میزان جذب توسط اسپکتوفتومتر در طول موج‌های مشخص می‌توان تعداد سلول‌های زنده را تعیین کرد. این آزمون بر اساس استاندارد ISO 10993-5 انجام شده و هدف آن ارزیابی برون تنی سمیت سلولی می‌باشد.

آزمون سمیت سلولی مطابق استاندارد ISO10993-5 و به سه روش آزمون NRU، آزمون CFU و آزمون MTT و آزمون XTT انجام میگیرد. متداول ترین روش در ارزیابی سمیت سلولی، سنجش بقای سلولی به روش MTT یا (۳-(۴,۵-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) است.

اساس روش برای تست MTT سمیت سلولی

اساس این روش مبتنی بر شدت رنگ تولید شده در اثر فعالیت میتوکندری سلولها می­ باشد که در طول موج ۵۴۰ تا ۶۳۰ نانومتر اندازه­ گیری می­ شود و به طور مستقیم با تعداد سلول­های زنده متناسب است به طوری که افزایش یا کاهش تعداد سلول­های زنده به صورت خطی با فعالیت میتوکندری های سلول در ارتباط است.

رنگ تترازولیموم MTT در سلول­های فعال (به لحاظ متابولیکی)، إحیا می­ شود. دهیدروژنازهای میتوکندریایی در سلول­های زنده با تولید NADH و NADPH منجربه تشکیل رسوب نامحلول ارغوانی رنگ به نام فورمازان می­شوند. این رسوب می­تواند توسط ایزوپروپانول یا دی متیل سولفواکسید حل گردد. از سوی دیگر، سلول­های مرده، توانایی انجام این تبدیل را به دلیل فعال نبودن میتوکندری های خود نداشته و بنابراین سیگنالی را نشان نمی­ دهند. در این روش، تشکیل رنگ به عنوان نشانگری برای وجود سلول­های زنده مورد استفاده قرار می ­گیرد.

روش انجام آزمون MTT برای تست سمیت سلولی

آزمون سمیت سلولی مطابق استاندارد ISO10993-5 و به سه روش آزمون NRU، آزمون CFU و آزمون MTT و آزمون XTT انجام میگیرد. متداول ترین روش در ارزیابی سمیت سلولی، سنجش بقای سلولی به روش MTT یا (۳-(۴,۵-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) است.

در روش MTT، جهت بررسی سمیت سلولی یک فلاسک L929 کانفلوئنس را زير هود برده و در شرايط كاملاً استريل محيط رويي سلول را خالي نموده، سپس سطح سلول ها را با PBS شست و شو داده و سپس به آن تريپسين افزوده تا سلول‌ها از حالت كشيده و فيبروبلاستيك خارج شده و به شكل كروي در آيند.

سپس محيط ۱۰ % FBS دار (سرم جنین گاوی) روي آنها ريخته تا تريپسين خنثي شود. پس از آن سلول ها را درون لوله فالكون ريخته با دور rpm 1200 به مدت ۵ دقيقه سانتريفوژ مي شوند كه سلول ها از محيط جدا شده و در كف فالكون قرار گيرند.

سپس لوله فالكون را از سانتريفوژ خارج كرده و محيط رويي آن را دور ریخته و روي آن محيط ۱۰ % FBS دار ريخته و توسط لام نئوبار شمارش سلولی انجام می شود. به ازای هر خانه یک پلیت ۲۴ خانه ای به میزان ۱۰۴*۵ سلول در نظر گرفته می شود.

نمونه های استریل نیز در شرایط استریل در مرکز هر خانه از پلیت قرار داده و سوسپانسیون سلولی به آن اضافه می شود و به مدت ۲۴ ساعت در انكوباتور C37 و Co2 5 % قرار داده می شود. طبق استاندارد ISO 10993-5 پس از ۲۴ ساعت، محیط رویی سلول را برداشته و با PBS لایه سلولی شست و شو داده می شود و سپس محلول MTT (1mg/ml) به میزان کافی روی لایه سلولی ریخته می شود.

پلیت کشت به مدت ۳-۵ ساعت درون انکوباتور در تاریکی قرار می گیرد. پس از مدت زمان گفته شده سلول ها با PBS شست و شو می شود تا MTT واکنش نکرده خارج شود. محصول فرمازان ایجاد شده توسط حلال ایزوپروپانل حل می شود و جذب هر خانه در طول موج ۵۴۰ نانومتر خوانده می شود. میزان مانایی سلول (Cell Viability) حاصل کسر جذب هر نمونه بر نمونه کنترل (ظرف پلی استایرن) است.

 محاسبه درصد سلولهای زنده در تست سمیت سلولی

درصد سلول‌های زنده یا میزان بقای سلولی در بررسی سمیت سلولی، بر اساس رابطه زیر محاسبه می‌گردد:

۱۰۰ × جذب متوسط نمونه‌های کنترل / جذب متوسط نمونه‌های تیمار شده = درصد سلول‌های زنده

تست سمیت سلولی

تست سمیت سلولی

0 پاسخ

پاسخ دهید

میخواهید به بحث بپیوندید؟
مشارکت رایگان.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *