آزمون سمیت سلولی چیست؟
آزمون سمیت سلولی (Cytotoxicity Test) یکی از مهمترین تستهای زیستسازگاری است که برای ارزیابی اثرات سمی یک ماده بر سلولها انجام میشود. این تست بهطور گسترده در صنایع دارویی، پزشکی، و بیوتکنولوژی برای بررسی ایمنی و سازگاری مواد مختلف مورد استفاده قرار میگیرد.
سه نوع تست سمیت سلولی در سازمان بین المللی استاندارد بیان شده است:
آزمایش های عصاره، تماس مستقیم و تماس غیر مستقیم
سیستم تجزیه و تحلیل سلولی در زمان واقعی پتانسیل قابل توجهی را در رابطه با سمیت سلولی در سال های اخیر نشان می دهد. بررسی حاضر بینشی مختصر در مورد آزمایش سمیت سلولی آزمایشگاهی دستگاههای پزشکی ارائه میکند.
بر اساس اعلام سازمان بین المللی استاندارد (ISO) دستگاه های پزشکی علاوه بر خواص مکانیکی، فیزیکی و شیمیایی و یا میزان خوب بودن آنها در صورت تماس با بدن، باید تحت آزمایش های دقیق قرار گیرند تا زیست سازگاری آنها مشخص شود.
جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان تماس بگیرید.
ارزیابی کردن بیولوژیکی دستگاه های پزشکی : آزمایش های سمیت سلولی در آزمایشگاه
هیچ کس نمیخواهد با محصولات سمی یا مضر تماس پیدا کند، حتی اگر یک وسیله پزشکی باشد. در صورتی که محصول خاصیت آسیب رساندن یا تخریب سلول ها را داشته باشد، به آن سمیت سلولی می گویند. با این حال، سازندگان همیشه اطلاعات دقیق کافی از زنجیره تامین ندارند تا بتوانند سازگاری مواد را ارزیابی کنند - اینجاست که تست سمیت سلولی شرح داده شده در استاندارد ISO وارد عمل می شود. این یک آزمایش نسبتاً ارزان است که از محبوبیت زیادی برخوردار است و اغلب مورد استفاده قرار می گیرد - همچنین به این دلیل که سمیت سلولی طبق ISO تقریباً برای همه محصولات باید ارزیابی شود. بنابراین انجام آزمایش سمیت سلولی در مرحله توسعه برای شناسایی مواد مناسب و بعداً روی دستگاه نهایی (در صورت وجود استریل، در بسته بندی) ، مشخصات شیمیایی، منطقی است. تا بتوان نتایج را به وضوح تفسیر کرد و یک بیانیه قابل اعتماد بیان کرد.
انواع تستهای سمیت سلولی
آزمون MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)
- روش: این آزمون بر اساس فعالیت آنزیمی است که سلولهای زنده به نام MTT را به فرم رنگی برایmazan تبدیل میکنند. میزان تبدیل MTT به فرم رنگی به تعداد سلولهای زنده بستگی دارد.
- نتایج: کاهش در جذب رنگ نشاندهنده سمیت سلولی است، زیرا سلولهای زنده کمتر قادر به تبدیل MTT هستند.
آزمون XTT (Sodium 3'-[1-(phenylamino)-carbonyl]-3,4-tetrazolium-bis (4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid)
- روش: مشابه آزمون MTT، XTT به صورت رنگی تغییر میکند. سلولهای زنده آن را به فرم رنگی تبدیل میکنند که میزان آن به تعداد سلولهای زنده بستگی دارد.
- نتایج: مقدار رنگ تولید شده مستقیماً به تعداد سلولهای زنده مرتبط است و کاهش آن نشاندهنده سمیت است.
آزمون LDH (Lactate Dehydrogenase)
- روش: این آزمون به سنجش فعالیت آنزیم LDH در محیط کشت سلولها میپردازد. LDH معمولاً درون سلولها وجود دارد و در صورت آسیب به غشای سلولی به محیط کشت میریزد.
- نتایج: افزایش سطح LDH در محیط کشت نشاندهنده آسیب به سلولها و سمیت است.
آزمون Trypan Blue Exclusion
- روش: در این آزمون، سلولها با رنگدانه Trypan Blue که فقط سلولهای مرده را رنگی میکند، مخلوط میشوند. سلولهای زنده رنگ نمیگیرند.
- نتایج: شمارش سلولهای رنگی (مرده) نسبت به کل سلولها برای ارزیابی میزان سمیت استفاده میشود.
آزمون Comet Assay
- روش: این آزمون برای بررسی آسیب DNA در سلولها به کار میرود. سلولها تحت شرایط خاصی پردازش و سپس با استفاده از الکتروفورز، آسیب DNA ارزیابی میشود.
- نتایج: الگوهای آسیب DNA (شبیه به دنباله دنباله) در سلولها نشاندهنده سمیت و آسیب ژنتیکی است.
آزمون CellTiter-Glo
- روش: این آزمون برای اندازهگیری ATP (آدنوزین تریفسفات) که فقط در سلولهای زنده تولید میشود، طراحی شده است. مقدار ATP اندازهگیری شده به تعداد سلولهای زنده بستگی دارد.
- نتایج: کاهش در مقدار ATP نشاندهنده کاهش تعداد سلولهای زنده و سمیت سلولی است.
مراحل انجام تست سمیت سلولی
-
آمادهسازی نمونه:
- نمونهای از ماده یا ترکیب مورد آزمایش تهیه و به غلظتهای مختلف رقیق میشود.
-
کشت سلول:
- سلولهای مناسب برای آزمون کشت میشوند و به محیط کشت مناسب منتقل میشوند.
-
تماس با ماده:
- سلولها به مدت معین در معرض ماده مورد آزمایش قرار میگیرند.
-
اندازهگیری:
- پس از انکوباسیون، تستهای سمیت سلولی مختلف انجام میشود تا تعداد سلولهای زنده و میزان آسیب بررسی شود.
-
تحلیل دادهها:
- دادههای به دست آمده از تستها تحلیل میشود تا تعیین گردد که آیا ماده مورد آزمایش سمیت سلولی دارد یا خیر.
-
گزارشدهی:
- نتایج آزمونها در یک گزارش جامع مستند میشود که شامل تحلیلهای آماری و تفسیر دادهها است.
آزمایش با تماس مستقیم سلول/ماده، و همچنین تست با تماس غیر مستقیم سلول/ماده.
بسته به نوع نمونه، کاربرد و محل های کاربردی احتمالی، یک یا چند روش از آزمون های ذکر شده انتخاب می شود. آزمونها و نقاط پایانی گوناگونی وجود دارد و بسته به نوع اندازهگیری، معیارهای ارزیابی متفاوتی ممکن است اعمال شود:
تخمین آسیب سلولی ناشی از تغییرات مورفولوژیکی
اندازه گیری آسیب سلولی - ارزیابی بسته به مواد مورد استفاده
اندازه گیری رشد سلولی
اندازه گیری جنبه های خاص متابولیسم سلولی.
خواص مواد به طور خاص می تواند بر برنامه ریزی و اجرای آزمایش دقیق تأثیر بگذارد. به عنوان مثال، در مورد اسپندکس، از یک پروتکل تست متفاوت استفاده می شود که ویژگی های خاص را در نظر می گیرد.
مقالات بیشتر:
خدمات تست سمیت سلولی توسط نیکوفارمد
آزمایشگاه نیکوفارمد با ارائه خدمات تست سمیت سلولی با کیفیت و دقت بالا، نقش مهمی در ارزیابی ایمنی و زیستسازگاری مواد مختلف ایفا میکند. این آزمایشگاه با استفاده از تکنولوژیهای پیشرفته و تیم متخصص، تضمین میکند که نتایج تستها مطابق با بالاترین استانداردهای بینالمللی بوده و اطلاعات لازم برای بهبود و توسعه محصولات ایمن و کارآمد را فراهم میسازد.
سنجش های کمی
سنجش لوسیفراز-ATP - زنده ماندن سلولی یک بازخوانی جایگزین برای سمیت سلولی است. لوسیفراز آنزیمی است که معمولا مورد استفاده قرار می گیرد که لوسیفرین را در حضور ATP به اکسی لوسیفرین تبدیل می کند. ATP در سلول های زنده یافت می شود و متناسب با تعداد سلول های زنده موجود است. این سنجش با فرمت های با توان بالا سازگار است. همچنین یک بازخوانی حساس از سمیت سلولی در سلول های مختلف است. سنجش MTT – در سنجش سمیت سلولی MTT از رنگ 3-(4،5-دی متیل تیازول-2-ایل)-2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید استفاده می شود که معمولاً به عنوان MTT شناخته می شود. MTT یک ترکیب محلول در آب زرد رنگ است که توسط سوکسینات دهیدروژناز میتوکندری تقسیم می شود و باعث ایجاد فرمازان بنفش رنگ می شود. تبدیل MTT به فرمازان فقط در سلول های زنده اتفاق می افتد.
سنجش های کیفی
سنجشهای کیفی، مانند سنجش شستشوی MEM، آزمایش تماس مستقیم، و آزمایش انتشار آگار به ندرت استفاده میشوند. در این سنجشها، سلولها در معرض یک دارو یا ترکیب قرار میگیرند و تغییر شکل سلولی به صورت بصری، در مقیاس از پیش تعیینشده، ارزیابی میشود.
کیت های سنجش سمیت سلولی
کیتهای سنجش سمیت سلولی برای اندازهگیری از دست دادن یکپارچگی ساختاری یا عملکردی که با مرگ سلولی مرتبط است، طراحی شدهاند. بسیاری از سنجش های سمیت سلولی با شناسایی غشاهای سلولی آسیب دیده عمل می کنند. این کار با استفاده از رنگ غیرقابل نفوذ غشا یا با تشخیص اجزای سلولی که معمولاً در خارج از سلول یافت نمی شوند، مانند لاکتات دهیدروژناز (LDH) یا DNA انجام می شود. سنجشهای سمیت سلولی برای مطالعه اینکه چگونه جمعیتهای سلولی ممکن است تحت تأثیر عوامل مختلف، مانند عوامل دارویی و کاندیدای دارو قرار گیرند، مفید هستند.
دستگاه های پزشکی به طور گسترده ای در رشته های مختلف بالینی مورد استفاده قرار گرفته اند. از آنجایی که این وسایل تماس مستقیم با بافت ها و سلول های بدن دارند، نه تنها به خواص فیزیکی و شیمیایی خوبی نیاز دارند، بلکه باید زیست سازگاری خوبی نیز داشته باشند. امنیت تجهیزات پزشکی توسط دولت ها افزایش یافته است. مجموعه ای از استانداردهای بین المللی برای تجهیزات پزشکی (ISO) توسط ISO در سال 1992 منتشر شد بنابراین ایمنی در تحقیقات، تولید و استفاده بالینی را تضمین کردند. در بین تست های زیست سازگاری، سمیت سلولی به عنوان یک آزمایش پروژه آزمایشی و به عنوان یک شاخص مهم برای ارزیابی تجهیزات پزشکی ترجیح داده می شود، زیرا ساده، سریع، دارای حساسیت بالا است و می تواند حیوانات را از سمیت نجات دهد.
سنجش سمیت سلولی در شرایط آزمایشگاهی با تماس مستقیم با سلول
انجام آزمایش تماس مستقیم سلولی امکان ارزیابی کردن کیفی پتانسیل سیتوتوکسیک یک مورد آزمایشی را در تطابق با ISO فراهم می نماید. آزمایش با قرار دادن آیتم آزمایشی روی تک لایه سلول ها انجام می شود. مواد سیتوتوکسیک آزاد شده از آیتم آزمایشی ممکن است باعث تغییر شکل یا حتی لیز سلولهای زیر یا اطراف آیتم آزمایش شوند که میتواند به صورت میکروسکوپی ارزیابی شود.
مقالات بیشتر:
ارزیابی سمیت سلولی با ارزیابی میکروسکوپی پس از تماس مستقیم با سلول
نمونه های آزمایش و شاهد بر روی تک لایه سلولی از پیش کاشته شده بدون برهم زدن یکپارچگی تک لایه سلولی قرار می گیرند و در دمای 1±37 درجه سانتی گراد به مدت حداقل 24 ساعت انکوبه می شوند. بدشکلی، دژنراسیون، جدا شدن یا لیز سلول ها به عنوان اقداماتی برای سمیت سلولی استفاده می شود. واکنش بیولوژیکی در مقیاس 0 تا 4 توصیف و رتبه بندی شده است. در صورتی که پاسخ به ماده آزمایشی از درجه 2 (با واکنش خفیف) بیشتر نباشد، مورد آزمایشی الزامات آزمون را برآورده می کند.
تست های سمیت سلولی در سلول های پستانداران، پروکاریوتی (آزمون ایمز)
سنجش حیات سلولی در سلول های پستانداران و باکتری ها
ترکیبات شیمیایی، داروها، محصولات آرایشی و بهداشتی، عصاره های گیاهی طبیعی یا موادی که برای کاشت ایمپلنت استفاده می شوند می توانند اثر سمی بر سلول های باکتریایی یا پستانداران داشته باشند. مکانیسم های مختلفی برای سمیت وجود دارد، به عنوان مثال، از دست دادن یکپارچگی غشاء، سمیت لیزوزومی، مهار سنتز پروتئین یا تداخل در متابولیسم که با فناوری های مختلف قابل تشخیص است.
نه تنها برای توسعه داروها، لوازم آرایشی، عصاره های گیاهی یا مواد شیمیایی و ایمپلنت، بلکه برای محیط زیست نیز مهم است که بین عدم سمیت، سمیت ناچیز و قوی تمایز قائل شود. به عنوان مثال، ترکیباتی با فعالیت بیولوژیکی امیدوارکننده و سمیت سلولی ناچیز را نباید رد کرد، زیرا "دوز سم را می سازد"، یعنی همه چیز سم است و هیچ چیز بدون سم نیست، دوز به تنهایی باعث می شود که یک چیز یک چیز نباشد.
سنجش های زیستی مختلف و چندین رده سلولی یوکاریوتی و پروکاریوتی مختلف برای ارزیابی سمیت سلولی استفاده می شود. سنجشهای سمیت سلولی تغییرات سلولی یا متابولیکی مرتبط با سلولهای زنده یا غیرقابل زنده را تشخیص میدهند. سنجشهای مختلف میتوانند مکانیسمهای مختلفی را در سلولها شناسایی کنند، مانند فعالیتهای بیوشیمیایی در زنجیره انتقال الکترون، سنتز پروتئین، فعالیت لیزوزومی یا از دست دادن یکپارچگی غشاء، که نشانههای نشاندهنده سلولهای زنده هستند.
به عنوان مثال، نمکهای تترازولیوم مانند XTT یا سایر قالبهای ردوکس ابزار ارزشمندی برای ارزیابی سلولهای کمی زنده هستند، زیرا رنگها تنها توسط سلولهای فعال متابولیک کاهش مییابند.